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一处被忽视的词语创新
【“名家评红楼”系列评论】
一处被忽视的词语创新
——晴雯判词“心比天高”读思札记
作者：湖南师范大学文学院教授，中国红楼梦学会学术委员会委员 刘上生
《红楼梦》耐读耐思。有些明白如话的语词，看似一目了然，但细想却未必然。如泉眼清澈见底，却取之不竭挹之无穷。晴雯判词“心比天高”一语就是如此。
语义索源
查所有词典，“心比天高”作为一个词语或成语的出处都是《红楼梦》，可见系曹公首创无疑。
《红楼梦大辞典》（修订版）对“心比天高，身为下贱”的解释是：
“意谓晴雯虽然社会地位低下，出身卑贱，是当日赖大买来的‘奴才的奴才’，但心性极为高洁，最无阿谀奉承的奴才相，最富有反抗精神。”
“心性”以下是阐释“心比天高”的。这是对判词所涉文本内容的正确阐释，但并非解词。
同样引用此判词词语，《汉语大词典》的解释则是：
“形容心地高傲或所想超过现实。”
这是语义学的解释，它切合字义，从两个角度释“心”：一为“心地”即“心性”，指气质性格；二为“所想”即“心志”，或曰抱负追求为全面。不过依据这一解释“心比天高”很难作完全的正面理解，而是包含了复杂的肯定与否定双重内涵。“心地高傲”可以是对平庸的蔑视，但也可能是过分自视或对他人的傲慢；“所想超过现实”或是拥有高远的抱负追求，但也可能是脱离现实的幻想或空想。
两本权威辞书作出褒贬意义不一样的解释，这是由工具书的不同性质和目标决定的。人们也由此可以看到，当曹雪芹创造出“心比天高”一词时，已赋予其不一般的意义内涵。
这是一处被一般读者忽视的词语创新，以前似乎没有人做过探究。
“心比天高”语词为曹雪芹首创，但它并非无源之水。从语源看，它应来自“心高”一词，是“心高”的极端化表述。《红楼梦》中就用了“心高”。第72回《王熙凤恃强羞说病，来旺妇倚势霸成亲》中旺儿家的想求凤姐帮忙，把彩霞给儿子做媳妇，怕彩霞父母不肯，有几句话：
“若论那孩子倒好，据我素日私意儿试他，他心里没有甚说的，只是他老子娘两个老东西太心高了些。”
“心高”这里显然是贬斥意味。《汉语大辞典》引此文解释“心高”为“怀抱的希望远大”，应该是从“心高”字词本义言之，但在具体语境中，实际上往往包含对所述对象的不满，小说中来旺家的话就是如此。
《辞源》无“心高”一词。作为古人认定的思维器官（《孟子》所谓“心之官则思”），上古演化出“心广” “心远”等物理向度词语，“心酸”“心醉”等心理内涵词语，衍生出物理向度的“心高”大概是近古通俗语词作品出现后的事情，后来为社会接受通用。值得注意的是，作为词语的“心高”，一出现就附着某种否定意味，并结合成“心高气傲”等成语。元无名氏杂剧《冻苏秦》第一折：“我可也心高气傲惹人憎。”又作“心高气硬”，或“气傲心高”，明王錂《春芜记•反目》：“你平日里心高气硬，笑伊家今日无计谋生。”《二刻拍案惊奇》卷22：“自家想着当年的事，还有些气傲心高。只得作一长歌，当做似《莲花落》，满市唱着乞食。”《清史稿.允禵传》：“谕曰：‘允禵无知狂悖，气傲心高，朕望其改悔，以便加恩。’”在所有这些词语或成语中，“心高”都是同“气傲”“气硬”等贬义词语组合使用，又强化其否定性内涵的。结果，语词本义所应有的“心志高远”（如前引《汉语大词典》所释）的肯定性内涵就被掩盖了。明李孔修《貧居自述》（其四十五）是较早把“心”与“天”联系起来的：“惟有人心高似天，谁知造化五行偏。贪心欲享千年寿，立意徒劳万顷田……”这又是以“心高”为贪欲，从“所想超过现实”的另一负面角度运用语词。
大体言之，以“心高”为语源附着否定性内涵，这就是曹雪芹创造“心比天高”语词的语义基础和传统习惯。中性字面上附着如此负面倾向的语义，一定有深刻的社会时代背景，这是否反映了封建后期日趋保守平庸、压抑特立个性的社会心理，值得探究。
很显然，曹雪芹不仅创造了一个新词语，而且赋予新义，这本身就是一种具有突破意义的特立独行。
点石成金
无法否认，晴雯判词“心比天高”所用“心高”的基本语义与前代承传和《红楼梦》同一文本仍具有共通性。但是，曹雪芹的语词创新和语境创造，却实现了语义反转。《红楼梦》读者从判词里读出的绝不是贬斥嘲讽，而是赞赏慨叹。这是怎么回事呢？
因为曹雪芹不是孤立地创造了语词“心比天高”，而是把它放在极其富于哲理意义和社会意义的“美的毁灭”的悲剧性语境之中，创造完成。此处小说文本叙述云：
“首页上画着一幅画，既无人物，也非山水，不过是水墨滃染的满纸乌云浊雾而已。后有几行字迹，写的是：霁月难逢，彩云易散。心比天高，身为下贱。风流灵巧招人怨。寿夭多因诽谤生，多情公子空嗟念。”
判词前四句包含两层意思：把晴雯名字分解为“霁月”“彩云”，这两个意象都是天上美景，它是一种难得（“难逢”）但生命力极为脆弱（“易散”）的美。下接“心比天高”，显示晴雯神（心）对形（貌）的超越。这种精神美才具有现实超越性，这是一层意思。第二层通过“心比天高”与“身为下贱”的反差和对映，展现出“心”（人格精神追求）对“身”（身份地位）的超越，这一超越的意义更为重要。因为包含着对社会不平的正义抗争和反叛，是对晴雯的反奴人格的精辟高度概括。由此，判词就通过两种超越极赞了晴雯之人格之高与美，并使其成为晴雯反奴人格的意象符号。而画面上的“乌云浊雾”象征的黑暗势力与判词中揭露的对美好事物的嫉恨（“怨”“诽谤”）等人性丑恶、社会丑恶正是造成晴雯悲剧的原因，“嗟念”则鲜明表达了作者态度。这就使得“心比天高”弱化甚至消解了“心高”词语在流传中附着的否定性语义，而凸显其被淹没的肯定性语义。不仅于此，作者还通过“比天高”的夸张比拟手法将其语义推向了极致。天为至高，是中国古代自然天崇拜和天人合一的“天帝”“天命”崇拜的物理认识基础。“昊天罔极”（《诗经•蓼莪》），人至渺小。“心比天高”是一种冲击甚至突破感受极限的意象创造，“心高”这个长期附着否定语义的词语，在曹雪芹创造的语境中转化为赞颂之语了。这真是点石成金啊！
从今人的眼光苛求，晴雯的精神追求也许算不上什么高大上。但十八世纪的曹雪芹却表达了最热烈的肯定，甚至像宝玉视晴雯为“第一件大事”那样有些偏爱。其原因，八十年前，王昆仑先生在论述“晴雯的意识中心”时深刻指出：
“她自始至终表现着被压迫在封建统治下反抗者的本质——骨气。在小姐们中林黛玉有骨气，但晴雯是贫民，是孤儿，是丫鬟，因此晴雯的性格中最明显最突出的特征是身处奴才的地位却坚决反对奴才们谄媚主子、出卖自己的卑劣品质。简单地说，就是反奴性。……她反对别人的奴性，反对别人奴视自己，自己不肯以奴才自居。一直到最后，对无理的搜查，凭空的诬陷，这倔强的少女始终是坚决不屈服。”
这就是“心比天高“的本质内涵。笔者曾经指出，曹雪芹的这种情感取向不但与他个性中的“傲骨”相呼应，而且融入了他出身的世代受奴役的包衣曹家反奴人格的精神传承。有着深刻的民族历史文化和家族文化印记。毛泽东在论述鲁迅骨头最硬没有丝毫奴颜媚骨时就指出，这是最可宝贵的民族性格。
当然，曹雪芹所做的语义翻转并不是对原有语义的彻底否定，“心高”或“心比天高”的语义本来具有双重性内涵，作为语词符号，由于人性和个性的复杂性，这种矛盾还可能集中在某个人身上。晴雯就是如此。从身份说，她确是赖大家买来孝敬贾母的“奴才的奴才”，但由于贾母的喜爱，特别是贾宝玉的宠信，她又是等级奴役的受惠者；她既有“一样这屋里的人，谁又比谁更高贵些”的朴素平等观念，又有任意惩治小丫头的“爆炭”脾性：她的“只说大家横竖是在一处”的“痴心傻意”，固然比薛宝钗“送我上青云”，花袭人求“终身倚靠”的目标来得纯净高尚，但又确实是脱离现实的天真幻想。她的“风流灵巧”招人嫉恨，当然是由于人性和社会丑恶，也有其“心高气傲”自身的因素。这就使得晴雯悲剧，在社会悲剧、人性悲剧的主要内涵之外，还有性格悲剧的深刻意义。这正是曹雪芹用“多情公子空嗟念”一语写出他的复杂感受的原因，也是他着意运用“心高”语词又加以创新为“心比天高”作为晴雯判词的良苦用心。它的满纸乌云浊雾，既是愤怒控诉，也是沉重叹息。
然而，承认“心比天高”的语义双重性并不能否定它在判词语境中的基本内涵。归根结底，它是曹雪芹为钟爱的女奴晴雯作为美的精灵和反奴人格化身所精心创造的语词符号。在小说构思中，它既与后文现实晴雯形象及其悲剧描写相印证，又与晴雯逝后《芙蓉女儿诔》创造的浪漫女神形象前后映射，可以说，芙蓉女神形象乃“心比天高”的语词符号的具象和升华。
“心比天高”是精神飞腾翱翔的意象。受“天法道，道法自然”老庄哲学影响，曹雪芹笔下“心比天高”中的“天”，显然绝非至高无上的主宰或人格神，而是体现“道”的自然。他所称颂晴雯的“心”即精神追求，正是合乎自然的被李贽等先进思想家推崇的原初人性，纯真童心。正是以这种冲破传统与世俗的哲学思想和美学观念为基础，他在《芙蓉女儿诔》中把女奴晴雯创造成绝美女神：
“其为质则金玉不足喻其贵，其为性则冰雪不足喻其洁，其为神则星日不足喻其精，其为貌则花月不足喻其色”
这是内外俱臻极顶的美的精灵。可以很清楚地看到，“心比天高”的意象已融入其中，甚至可以说，它成为《芙蓉诔》女神形象的构思起点。作者创造的芙蓉女神形象，已不同于尚存某些性格缺陷的现实人物晴雯。例如“姊妹悉慕媖娴，妪媪咸仰惠德”，就与晴雯人缘关系的实际大相径庭。我们不可能通过诔文所写还原现实晴雯和宝晴关系细节，因为芙蓉女神已是对现实人物晴雯的理想化修正和升华。而这一升华的哲思和审美意象，作者早已在判词中对现实人物晴雯“心比天高”语词符号创造埋下了伏笔。
晴雯是曹雪芹创造的文学史上第一位反奴人格女奴形象。曹雪芹又把首创的“心比天高”词语献给了晴雯。新词语，新语境，新语义，与新形象融合一体。
二水分流
在《红楼梦》的语言接受史中，晴雯判词“心比天高”很耐人寻味。不但在阅读中家喻户晓，而且进入现代文学语汇，为许多作家作者所瞩目。这种情况，在小说文本中实属罕见。
最早吸收这一词语的是文学大师鲁迅。《故事新编.出关》中，关尹喜同部属议论出关的老子说：
“……他说‘无为而无不为’。这家伙真是‘心高于天，命薄如纸’，想‘无不为’，就只好‘无为’。一有所爱，就不能无不爱。那里还能恋爱，敢恋爱？……”
“心高于天，命薄如纸”明显是对“心比天高，身为下贱”的仿制，用以表现关尹喜对老子的嘲讽之意。鲁迅在《“出关”的“关”》一文中说：“我同意于关尹子的嘲笑。因为老子是“无为而无不为”的一事不做，徒作大言的空谈家。要无所不为，就只能一无所为。他是连老婆也娶不成的。可见鲁迅在此用“心比天高”的语意已完全不同于曹雪芹了。在某种意义上，它是对《红楼梦》的逆反，可以说，又回复到“心高”偏向否定性内涵的原初语意了。不过，当鲁迅以“心”与“命”即精神追求与现实遭际联系对照的时候，他已经把曹公“心”与“身”的个体（小宇宙）自我映照拓展到无比广阔的世界（大宇宙）了。
于是就出现了两位文学大师同一语词的语义分歧：“心比天高，身为下贱”的褒扬与“心高于天，命薄如纸”的贬讽，而且它们都得以广泛流传并进入文学语汇宝库。它使人们联想起《红楼梦》黛钗双峰并立二水分流影响后世的奇景，只是这里还多一种代际的继承和创新。搜索百度，用此词语者，数不胜数，虽然在“形容心地高傲或所想超过现实”的基本语义大体一致，但其具体实现则因语境而异，取负面意义者，如：“不能养活他一辈子。那么个小丫头，不要心比天高。”（林语堂《京华烟云》）“你怎么能那样评价他呢？他不是心比天高，命如纸薄，也不是失却根本，忘形得意。”（贾平凹《浮躁》）其中，命相之类或含命相观念之作尤多。而表正面意义者如：“看不起苏惠，这也说明芳卿这个人也是心比天高，才华也是出众，而且理想事业是追随曹雪芹的。”（胡德平《曹雪芹在西山》）“有心比天高，来造凌云塔。”（范诗银《卜算子•繁塔》）即使用鲁迅语，也可用于揄扬：“他（她）们有才，有德，有能，个个心比天高，命如纸薄。”（章诒和《往事并不如烟》）励志之作多仿此。笔者在研究包衣曹家精神传承时，也借用了“心比天高，身为下贱”二语，论述曹寅的反奴人格和自由心性，及其对曹雪芹和《红楼梦》的影响。
语义在语境创造中实现和闪光。这将是一个绵绵不绝，永无止境的过程。曹雪芹就是这一语言奇观的开拓者。（刘上生）
来源： 光明网-文艺评论频道
宝藏！转基因株系检测的N种方法
伯小远经常收到同学咨询如何检测过表达/突变体株系的问题，今天小远就再来分享一下吧。
检测过表达株系
PCR检测真核抗性基因or目的基因
对聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR），咱就不多说了，每个进入分子实验室的同学最先接触的实验除了提质粒，那就是PCR啦。
检测过表达株系，可以检测两类基因：（1）真核抗性基因，常见的是潮霉素磷酸转移酶基因（HptII）、草丁膦乙酰转移酶基因（Bar）、新霉素磷酸转移酶基因（NPTII）等，这些基因序列固定，每个实验室估计都有固定的、“传承”下来的引物序列；（2）目的基因，在T-DNA上设计一条引物，在目的基因上设计另一条引物，用这两条引物来进行PCR扩增。
图1 PCR体系。PCR反应体系由DNA模板、引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶和PCR反应缓冲液组成。PCR反应在PCR仪中通过控制反应体系的温度来实现。
图2 PCR的扩增过程。PCR包含下列三步反应：变性（denaturation）、退火（annealing）、延伸（elongation），此三步反应为一个循环，如此反复循环可以使DNA以指数形式进行扩增。
举例
图3 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物 (Zhou et al., 2016)。除了7、12、94号株系外，所有的转基因株系都扩增出了Bar基因140bp的条带。
荧光定量PCR检测mRNA的相对表达量
PCR扩增是一种指数扩增，理想状态下，当把PCR终点的判断信号固定成一个统一的值（即荧光阈值），那么循环数与起始浓度的对数就是线性关系，这就是荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR）相对定量的基本原理。
检测过表达株系，可以先提取目标株系的总RNA，然后将RNA逆转录成cDNA，通过qRT-PCR实验检测靶标的相对表达量。当然，一个内参基因和一个对照样本也是实验中必要的。再利用∆∆Ct法即2-([Ct（样品基因)-Ct(样品内参基因)]–[Ct（对照目的基因)-Ct(对照内参基因)])计算过表达株系目的基因的转录水平变化。有的实验室可以用软件直接生成相对表达量的柱状图，有的实验室也有固定的、“传承”下来的Excel表格可用来计算数据，再根据数据做图。
当然，大家也别忘记，qRT-PCR技术也可用于绝对定量检测、拷贝数鉴定、基因型鉴定等实验。
图4 两种不同原理的荧光定量PCR扩增过程。（左）Taqman探针法：使用含有荧光基团的Taqman探针，当探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，但在进行延伸反应时，聚合酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，即每扩增一条链，就有一个荧光分子形成，因此荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。该方法可以在同一反应中进行多靶点的检测。（右）SYBR Green I法：使用染料分子SYBR Green I，SYBR Green I能与DNA双链的小沟特异性的结合，游离的SYBR Green I几乎没有荧光信号，但结合双链DNA后，其荧光信号可呈数百倍的增加。随PCR产物的增加，PCR产物与染料的结合量也增大，其荧光信号强度代表双链DNA分子的数量。
举例
图5 qRT-PCR检测ScCHS2、ScF3H1、ScDFR3、ScANS、ScAG、ScAGL11和ScbHLH17基因的在五个时期的相对表达量 (Qi et al., 2022)。
Western blot检测目的蛋白
蛋白质免疫印迹实验（Western blot）是将细胞或组织中的蛋白质通过电泳分离，从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特异性抗体检测某种抗原（目的蛋白）的一种检测实验。使用特异性抗体对样品进行着色，通过分析着色的位置和深浅获得目的蛋白在细胞或组织中表达情况的信息。
Western blot中有两种一抗可以使用：（1）目的蛋白的特异性抗体，一般需要委托公司来生产，成本昂贵。（2）针对特定标签的标签抗体，商业化程度高、特异性强。使用这种抗体时，别忘记在构建转基因载体时，在目的蛋白的N端或C端加上标签，常见的例如His，Flag，Myc等。标签蛋白与目的蛋白就融合在一起，通过检测标签蛋白就可以来表征目的蛋白的表达情况。
图6 Western blot的实验过程。实验流程大致分为：提蛋白，蛋白含量测定，制胶，聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白样品，转膜，封闭，孵育一抗，漂洗，孵育二抗，漂洗，加入化学发光底物，胶片曝光，得到结果图。
举例
图7 FIE蛋白的表达量随春化时间的延长而变化 (Wood et al., 2006)。拟南芥在16h光照/8h黑暗的正常条件下培养12d后转移至4℃培养，在培养的第0、1、8、16、32d取样检测FIE蛋白的表达情况（1-5泳道），在结束32d春化后移回正常培养条件2d后取样检测FIE蛋白的表达情况（第6泳道）。
免疫层析试纸条检测真核抗性蛋白
免疫层析试纸条是一种快速免疫分析技术，是目前常见的检测方法之一，具有操作简单、检测快速、结果易观察、样品需要量少、成本低、携带和保存方便等优点，适合现场检测及大规模筛查检测。
常见的免疫层析试纸条是基于对转基因株系中外源蛋白的检测，如Cry1Ac、Cry2A、BAR、PAT、CP4-EPSPS等蛋白。只需将植物的叶片或种子经过简单的破碎处理，就可进行检测，5-15min即可得到结果。
图8 免疫层析试纸条结构 (夏启玉等, 2017)。试纸条由样品垫、结合垫、反应膜、检测线（T线）、质控线（C线）、吸收垫及背衬组成。免疫层析试纸条可分为两类，夹心法和竞争法。以胶体金夹心法为例，简单介绍一下原理：将金标抗体（Au）Ab1吸附在结合垫上，捕获抗体Ab2喷涂于T线，抗Ab1二抗喷涂于C线。待测样品通过毛细管作用向前层析，层析至结合垫上时溶解其上的金标抗体，如果样品中含有待检抗原（Ag）则会与（Au） Ab1结合，形成（Au） Ab1-Ag继续向前层析，前行到T线时被抗体Ab2捕获形成（Au） Ab1-Ag-Ab2的复合物，T线显现红色条带，过量的（Au） Ab1继续前行，在C线处被抗Ab1二抗捕获形成复合物，C线也显示红色条带，为阳性结果；若T线无条带，C线为红色条带，为阴性结果。
举例
图9 免疫层析试纸条检测Bar蛋白。图片来源：伯远生物转化部大豆组。鉴定结果显示全部为阳性苗噢！
TAIL PCR鉴定T-DNA插入位点
T-DNA插入位点的获得对于植物功能基因组学研究及转基因植物的筛选鉴定十分重要。检测T-DNA在基因组上的插入位点，通常使用热不对称交错PCR（Thermal Asymmetric Interlaced PCR，简称TAIL-PCR），TAIL-PCR是一种用来分离与已知序列邻近的未知DNA序列的分子生物学技术 (Liu et al.,1995, Tatjana Singer et al.,2003)。
TAIL-PCR技术的基本原理是利用目标序列旁的已知序列设计3个嵌套的特异性引物（简称sp1、sp2和sp3，约20bp），用它们分别和1个具有低Tm值的短的（14bp）随机简并引物（简称AD）相组合，以基因组DNA为模板，根据引物的长短和特异性的差异设计不对称的温度循环，通过分级反应来扩增特异引物。由一个特异性引物和一个简并引物相组合构成的PCR反应叫做“半特异性PCR”。这种反应会产生3种不同类型的产物：（1）由特异性引物和简并引物扩增出的产物；（2）由同一特异性引物扩增出的产物；（3）由同一简并引物扩增出的产物。在TAIL-PCR反应中，后两种非目标产物可以通过以嵌套的特异性引物进行的后续反应来消除。
图10 TAIL-PCR的扩增原理。图片来源：伯远生物官网。
基于二代测序技术鉴定T-DNA插入位点
TAIL-PCR除了存在操作复杂、耗费时间等缺点外，也存在特异性较差、效率低等问题。基于二代测序技术鉴定T-DNA插入位点的方法也逐渐被许多研究者使用。
首先将基因组用超声波片段化，末端修复加A后，连接一个带有barcode的接头序列，barcode用于区分不同的样品，接头序列为Illumina测序平台通用测序接头P5和P7，然后根据插入片段和接头序列，分别设计特异性引物扩增片段，再进行二代测序。当然，也可以不进行特异性扩增及纯化而直接进行测序，也就是单纯的全基因组重测序（图12），这种方法也是可以的，只是测序量较大、成本较高。
图11 基于二代测序技术鉴定T-DNA插入位点的实验原理。图片来源：伯远生物官网。
举例
图12 基于二代测序技术获得的T-DNA插入位点检测结果 (Lv et al., 2021)。对三个阳性植株（#2、#3、#7）进行基因组测序，对基因组进行25-31倍的覆盖测序，得到1.3亿条clean reads，再和参考基因组、T-DNA序列进行比对分析。
Southern blot鉴定拷贝数
在转化过程中，外源T-DNA随机插入植物基因组，插入的位点和拷贝数都不固定。插入的拷贝数较少则能较好的表达外源基因，插入的拷贝数多则可能会导致外源基因表达不稳定甚至沉默。因此，检测T0代植株外源基因的拷贝数是研究其分子机制的基础实验之一。
Southern blot是一种常用的DNA定量的分子生物学方法。其原理是将待测的DNA样品用限制性内切酶消化，并通过琼脂糖凝胶电泳分离，再固定在固相载体（硝酸纤维膜或尼龙膜）上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交信号，通过检测信号的有无、强弱可以对样品定性、定量，从而计算出插入的拷贝数。
图13 Southern blot的实验过程。图片来源：LibreTexts。
举例
图14 Southern blot检测T0植株中T-DNA的拷贝数，使用HPT基因的部分序列作为探针 (Wu et al., 2015)。
荧光定量PCR鉴定拷贝数
Southern blot鉴定拷贝数的优点是准确性高、特异性强，是鉴定拷贝数的金标准，缺点是成本较高、操作复杂，而且受到酶切位点的限制，另一种基于qRT-PCR绝对定量技术鉴定拷贝数的文献近些年逐渐增多。
qRT-PCR鉴定拷贝数，一般使用绝对定量的方法，通常的做法是提取目标植株的总DNA，扩增出靶标基因，然后将该基因克隆到载体上，提取高纯度重组载体进行拷贝数定量，绘制靶标基因的标准曲线。然后再选择一个拷贝数已知的内参基因（内参基因一般选择拷贝数少，同一物种内的不同品种间具有稳定的序列结构和拷贝数的一类基因），绘制拷贝数定量曲线。分别测定样本中靶标基因和参照基因的拷贝数，靶标基因与参照基因检测值的倍比×参照基因的拷贝数即得到靶标基因拷贝数。
表1 使用∆∆Ct法计算拷贝数 (Bubner et al., 2004)。
如何鉴定植株是否纯合
对于过表达的株系，一般没必要等植株纯合再进行后续分子实验，因为过表达其实就相当于在基因组中插入了一个显性基因，杂合子是绝对可以进行后续实验的。如果实在是有必要鉴定转基因植株是否纯合，目前有两种方法：（1）让T0代自交，得到T1代，根据孟德尔遗传定律，按照性状3:1分离，舍弃1份的阴性植株，再让剩下的3份T1代继续自交，得到T2植株，按照子代性状无分离和性状3:1分离来推测出T1代的纯合株系和杂合株系。（2）结合T0和T1植株的拷贝数来分析，例如当T0代为1个拷贝而T1代为2个拷贝时，则该T1植株为纯合株系（表2）。
举例
表2 分析T0和T1植株的拷贝数，粗体数字表示由相应的T0、T1植株中的拷贝数鉴定得到的纯合植株 （Głowacka et al., 2016）。
检测基因编辑株系
PCR检测基因组靶点
使用CRISPR/Cas系统编辑植株会导致植物基因组被编辑，编辑形式为插入、删除、替换，因此在检测基因编辑株系时，在被编辑的靶位点两侧设计合适的引物，对靶位点及附近的序列进行PCR扩增，再进行一代测序，并把测序结果上传至DSDcode网站进行解析 (Liu et al., 2015)，网站会根据测序的信号双峰嵌套位置和强弱判断突变类型，但当位点存在两种以上的突变类型时，该网站无法进行区分。此时，可将PCR产物进行克隆、测序，可以确切判断具体的突变类型。
图15 在基因组靶位点附近1000bp范围内设计引物进行扩增、检测，最好控制在500-700bp范围内。图片来源：伯远生物官网。
植物细胞中有两种途径可以修复DNA双链断裂（DSBs）：同源重组（Homologous recombination，HR）和非同源末端连接（Non-homologous end joining，NHEJ）。HR在植物中的修复效率非常低，NHEJ在DNA双链断裂处容易产生少数碱基的插入或缺失，导致基因失活，这也是目前CRISPR/Cas基因编辑系统的主要修复途径。
对于二倍体植物来说，NHEJ修复之后会产生5种突变类型：
（1）没有产生任何突变；
（2）单等位基因突变，只有一个等位基因发生突变，也称杂合突变；
（3）双等位基因杂合突变，两个等位基因都发生突变，但是突变的类型不一样，该突变形式常导致软件无法区分，需要继续做克隆及测序来进行鉴定；
（4）双等位基因纯合突变，两个等位基因发生相同的突变，这是研究者们最想要的突变类型；
（5）嵌合体，同一个植株上有3种或3种以上的突变类型。
多倍体产生的基因编辑类型同上。
对于基因编辑靶点检测，难度最大的是对多倍体的检测或者多个同源基因的检测，我们公司的经验是先下载同源序列，再根据同源序列设计可区分不同位置上的靶点的引物，在扩增基因编辑苗之前可用野生型株系的基因组作为模板提前将引物筛选一下，再用筛出的比较合适的引物来扩增编辑苗。举个例子，油菜是异源四倍体，不管是在设计靶点还是设计检测引物时，都要考虑其四倍体的特性（图17）。
举例
图16 番茄nor-like基因的两个突变株系的编辑情况 (Gao et al., 2018)。（a）nor-like基因的结构及四个靶点的示意图；（b）nor-like基因的两个突变株系#1、#11的编辑情况，这两个突变株系均为双等位纯合突变，#1有1个碱基的插入，#11有11个碱基的删除，红色序列表示靶位点，绿色序列表示被编辑的情况，蓝色序列表示PAM序列。
图17 对油菜BnSFAR4基因的靶点设计及突变株系的靶点检测结果 (Karunarathna et al., 2020)。（a）在BnSFAR4基因的外显子II中选择了一个20bp的区域作为靶点；（b）对基因编辑株系的四个BnSFAR4基因的靶点进行检测后的结果示意。红色序列为突变后序列。
基于二代测序技术的高通量基因编辑检测
上述使用一代测序的方法（Sanger测序）鉴定突变体材料效率较低，无法大规模的对突变材料进行鉴定分析，基于二代测序技术的高通量基因编辑检测方法不仅大幅提高了测序通量，同时也降低了测序成本，当然，还有一个显著的优点是，可以精准的获得每个样品的突变类型和序列，不会出现一代测序检测方法中常出现的不确定突变形式的问题。后者基于多重PCR建库技术，对靶标进行两轮PCR来达到建库和富集的目的 (Liu et al., 2019)（图18）。
图18 基于二代测序技术的高通量基因编辑检测流程图。基本的实验步骤如下：（1）针对靶位点区间设计特异性引物，可以在上下游特异性引物带上barcode序列，方便多样品混合；（2）利用步骤1针对靶位点设计特异性引物，对目的片段进行首轮PCR，获得目的片段；（3）以步骤2中扩增获得片段为基础，进行第二轮PCR扩增，加上测序接头；（4）混样后，即可进行二代测序；（5）对测序结果进行比对、分析。
举例
表3 基于二代测序技术的高通量基因编辑检测的结果展示。表格来源：伯远生物检测部。我司提供给客户的表格包含株系号、基因号、靶标序列、Reads数、突变类型、突变后的序列等信息。
注：M: 完全匹配；D：碱基缺失；I：碱基插入。
检测基因编辑突变体库
在植物中，目前已有许多使用CRISPR/Cas技术创建突变体库的报道。同时，我司在利用CRISPR技术创建大规模突变体库方面拥有丰富的经验，多次为合作伙伴提供大型突变体库项目的整体解决方案，在设计靶标、构建基因编辑载体库、采用何种方式进行遗传转化以及对突变体植株的后期管理已形成完善的全周期管理系统。可参考文章“秋天的第一篇推送——突变体库，如何创建”。
对于突变体库的检测，大致可分为以下检测过程：（1）经过遗传转化出苗后PCR进行阳性鉴定；（2）确认每株苗中的sgRNA，二代测序检测；（3）确认突变类型，扩增靶标，二代测序检测。
对于（1）和（3），咱都比较熟悉了，所以只讲一下（2），因为创建突变体库一般采用的是混转策略，将含有不同基因编辑载体（即含有不同sgRNA的载体）的农杆菌混在一起，再对外植体进行侵染、共培、分化出苗等步骤，所以在这个过程中，阳性植株中的sgRNA具体是哪一个我们是不清楚的，并且还可能会同时插入多个sgRNA，因此，我们需要根据插入的sgRNA的情况来确定需要检测的靶标。
对于转化阳性率很高的物种，可以把（1）省略，直接进行（2）和（3）即可，因为未检测到sgRNA，则可认为是阴性苗，直接舍弃即可。
举例
表4 鉴定突变体库的sgRNA（部分展示）。表格来源：伯远生物检测部。
T-DNA插入突变体检测
在基因编辑突变体库出现之前，很多植物已经有突变体库，这些突变体库中有一些是T-DNA插入突变体，即T-DNA插入到植物的基因组中，引起基因失活，即产生了功能缺失性突变，比较出名的例如拟南芥SALK突变体库，其材料背景为Columbia-0，使用的转化载体为pBIN-pROK2，真核抗性为Kan，检测购买的SALK突变体是否纯合，可参考文章“快收好，拟南芥突变体鉴定方法”。
一些其他的检测方法
数字PCR是近年来发展起来的一种精确的核酸绝对定量方法，该方法将微量样品进行极度稀释和分液，直到每个细分的待测样品中所含有的待测分子数不超过1个后，再将所有细分的待测样品进行PCR扩增，然后对扩增反应的样品逐一计数，从而判断待测样品的最初浓度。其优势在于不需要依赖Ct值和标准曲线，就能够实现对起始样品的绝对定量。
等温扩增技术也是近年发展起来的一种快速核酸检测技术，因其扩增过程不需要特殊仪器、不需要温度循环，即可实现扩增。其中环介导等温扩增技术（LAMP）已经得到较多的应用，通过设计的引物能特异性地识别靶标序列的6个区域，在链置换性聚合酶（Bst酶）作用下，在恒温（60-65℃）条件下，大约40-60min即可完成核酸扩增 (张晓磊等, 2020)。
当然，还有其他很多检测方法，篇幅所限，伯小远就不再多写啦。
小远叨叨
过表达/突变体株系检测粗略可分为两大类，一类是基于核酸序列的方法，如定性PCR、荧光定量PCR、数字PCR、等温扩增等；另一类则是基于免疫学的方法，如ELISA、Western、试纸条等。随着政策的利好、技术的发展，灵敏、快速、高通量、自动化的转基因检测方法成为了发展趋势。这需要我们不断的创新与进步，愿更多有志之士参与到生命科学的产业化进程中来！
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NO.2伯远生物可提供以下技术服务及试剂Technical service
转基因植株检测
基因编辑植株检测（基于一代测序）
高通量基因编辑植株检测（基于二代测序）
拟南芥SALK突变体检测
荧光定量PCR检测（相对表达量、拷贝数鉴定、基因分型、特殊RNA检测）
基于二代测序技术鉴定T-DNA插入位
2×Taq PCR Mix、琼脂糖、DNA Marker等
